非洲马瘟的介绍

1. 非洲马瘟的介绍

非洲马瘟是由非洲马瘟病毒引起的马属动物的一种急性或亚急性传染病。以发热、皮下结缔组织与肺水肿以及内脏出血为特征，只能通过昆虫传播。马对此病的易感性最高，病死率高达95%。中国尚无本病发生。OIE将其列为A类疫病。本病发生有明显的季节性和地域性，多见于温热潮湿季节，常呈地方流行或暴发流行，传播迅速；厚霜、地势高燥、自然屏障等影响媒介昆虫繁殖或运动的气候、地理条件，将使本病显著减少。

2. 非洲马瘟的临床症状

潜伏期通常为7～14天，短的仅2天。中国《陆生动物卫生法典》规定，非洲马瘟的感染期 为40天。按病程长短、症状和病变部位，一般分为肺型(急性型)、心型(亚急性型、水肿型)、肺心型、发热型和神经型。肺型：多见于本病流行暴发初期或新发病的地区。呈急性经过。病畜体温升高达40～42℃，精神沉郁、呼吸困难，心跳加快。眼结膜潮红，羞明流泪。肺出现严重水肿，呼吸困难，并有剧烈咳嗽，鼻孔扩张，流出大量含泡沫样液体。病程5～7天，常因窒息而死。（1）肺型：呈急性经过多见于流行初期或新发生此病的地区。病马体温突然升高达41－42℃，持续1－2天降至常温。病马表现为结膜炎，呼吸迫促、脉搏加快。5－7天后死亡；（2）心型：为亚急性经过，病程缓慢。病马体温不超过40.5℃，持续10多天可见眼窝处发生水肿。其后消退或扩散到头部、舌。有的蔓延至颈部、胸腹下甚至四肢。由于肺的水肿而引起心包炎、心肌炎、心内膜炎。伴有心脏衰弱的症状。该型康复率较高；（3）肺心型：呈亚急性经过，多发生于有一定抵抗力的马匹。具有肺型、心型的临诊症状；（4）发热型：此型℃多见于免疫或部分免疫的马匹。该型潜伏期长，病程短。表现为病马体温升高到40℃，持续1－3天。病马表现厌食，结膜微红，脉搏呼吸增数。该病的诊断必须经过实验室检查方能确诊。可采集发热期病马血液或病死马的脾脏进行病毒分离。同时还可采取发病初期及恢复期的马血清进行血清学诊断。非洲马瘟病死率变动幅度很大，最低为10%～25%，最高可达90%～95%，骡、驴病死率较低。耐过本病的马匹只能对这同一型病毒的再感染有一定的免疫力。

3. 非洲马瘟的发病机理

带毒昆虫叮咬动物后，病毒进入体内。病毒主要在肺，脾和淋巴结中复制，病毒存在于马的血液，渗出液，组液等体液中，大部分是吸附着于红细胞上。病毒的增殖导致特定组织器官或身体某些部位的血管渗透性增加，引起肺泡，胸膜下和肺间质水肿，有时也出现严重的胸腔积水。 该期主要引起变性变化。病毒由呼吸道进入机体，被吞噬细胞带至其他部位，在脾、法氏囊和胸腺引起溶细胞性感染，3-6天达高峰。主要靶细胞为B细胞和某些激活的T细胞。早期感染的致坏死作用引起急性炎症反应，约在第7天出现暂时性免疫抑制。最后法氏囊和胸腺萎缩。B细胞坏死感染引起T细胞激活的应答对发病机理有很重要的意义，因为这一过程提供了大量供转化的靶细胞。转化需要有4个条件:第一，对感染易感；第二，对病毒复制（潜伏感染）的内在或外在控制；第三，发生细胞分裂以整合病毒基因组；第四，表达病毒肿瘤基因或激活细胞肿瘤基因。在CMI应答导致转入潜伏感染时被感染的激活T细胞满足上述条件。因此，甚至在早期在溶细胞感染期就有转化细胞或至少是供转化的靶细胞存在。免疫应答在MD的发病机理上起重要作用，而MD也引起严重的免疫抑制。免疫抑制可由MDV对淋巴细胞的溶细胞感染直接引起，也可由抑制细胞群体的作用间接引起，两者都重要。

4. 非洲马瘟的流行病学

病毒的贮藏宿主，目前尚未研究清楚。马、骡、驴、斑马是病毒的易感宿主。马尤其幼龄马易感性最高，骡、驴依次降低。大象、野驴、骆驼、狗因接触感染的血及马肉也偶可感染。本病主要通过媒介昆虫如库蠓、伊蚊和库蚊吸血传播。传染源为病马、带毒马及其血液、内脏、精液、尿、分泌物及所有脱落组织。马的病毒血症期一般持续4～8天，长的可达18天；斑马、驴病毒血症期可持续28天以上。　 本病发生有明显的季节性和地域性，多见于温热潮湿季节，常呈地方流行或暴发流行，传播迅速；厚霜、地势高燥、自然屏障等影响媒介昆虫繁殖或运动的气候、地理条件，将使本病显著减少。

5. 非洲马瘟的病原学

非洲马瘟病毒属呼肠孤病毒科环状病毒属。现已知有9个血清型，各型之间没有交互免疫关系，不同型病毒的毒力强弱也不相同。 病毒在37℃下可存活37天，而50℃3小时、60℃15分钟可被灭活。在pH6.0～10之间稳定，在pH3.0时迅速死亡。能被乙醚及0.4%β－丙烯内脂灭活。0.1%福尔马林48小时，以及被石炭酸和碘伏灭活。

6. 非洲马瘟的诊断

根据临床症状和病理变化可做出初步诊断，确诊需进一步做实验室诊断。普通诊断：（1）接种马匹试验：将病料制成1：10倍无菌悬液，接种健马，每匹静脉注射5毫升。一般4-10天体温升至40-41℃，显现非洲马瘟症状。（2）接种小白鼠试验：将病料悬液接种2-4日龄乳鼠，每鼠脑仙接种0.01毫升，从第4天起可产生临床症状，出现中枢神经系统感染或衰竭死亡。（3）其他试验：补体结合试验、中和试验、荧光抗体试验、琼脂扩散试验、红细胞凝集试验等都可确诊本病。实验室诊断：在国际贸易中检测的指定诊断方法有补体结合试验、酶联免疫吸附试验。替代诊断方法有病毒中和试验。样品采集：用于病原分离宜采集发热期病畜全血，用OPG(50%甘油+O.5%草酸钠+O.5%石炭酸)或肝素(按10IU/毫升添加)抗凝，于4℃下保存或送检；或刚死亡动物的脾、肺和淋巴结(取2～4克小块)，置10%甘油缓冲液，于4℃下保存或送检。病毒分离：乳鼠接种、细胞接种(BHK、MS、Vero)、接种鸡胚。病毒鉴定：酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验、聚合酶链反应(PCR)。血清学诊断：酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验、免疫印迹。用于血清学诊断宜采集血清(最好采双份血清，分别在急性期和康复期，或相隔21天采取，于－20℃下保存)。

7. 非洲马瘟的病毒详解

 该病毒无囊膜，直径约75nm，有两层20面体对称的衣壳，由32个壳粒组成。基因组由10个大小不等的双链RNA片段构成，3个大的为L1～L3，3个中等的为M4～M6，4个小的为S7～S10，编码10个蛋白(VP1～VP7和NS1，NS2，NS3/NS3A)。内衣壳由2个主要蛋白VP3和VP7以及3个次要蛋白VP1、VP4和VP6构成，其中VP6被认为是病毒dsRNA的解旋酶[2]。外衣壳由2个蛋白VP2和VP5构成，当病毒通过细胞膜时会被脱掉。此外，至少还有3个非结构蛋白(NS1，NS2和NS3/3A)存在于受感染的细胞中。 该病毒有9个抗原性不同的血清型[3]。虽然在野外没有发现任何型内变异的证据，但通常认为血清型之间有某些交叉的亲缘关系，尤其是在AHSV-1和2，AHSV-3和7，AHSV-5和8，以及AHSV-6和9之间。 2.1　VP2蛋白VP2蛋白由L2基因编码，是病毒最主要的型特异性抗原，与VP5一起能与病毒的中和抗体发生反应。AHSV9个血清型L2基因的cDNA有典型的环状病毒5′-GTT和TAC-3′的末端序列。L2基因的ORF编码蛋白的分子质量约为123ku。VP2蛋白序列在AHSV9个血清型中的变动范围为47.6%～71.4%，是AHSV变异率最大的蛋白[4]。BentleyL等[5]用噬菌体展示技术配合多种抗血清鉴定了重组AHSV-3VP2蛋白的多个抗原区域。大部分抗原位点和中和位点都在252aa～488aa区域。这个区域在病毒各血清型之间不仅差异大，而且大部分是亲水性氨基酸，其中369aa～403aa之间有一个线性抗原表位[6]。此外，在有交叉反应的病毒血清型之间，这些抗原位点的内部序列有较高的一致性，因此，有交叉反应的血清型病毒之间有更高的同源性。这可解释血清型之间的血清学交叉反应。AHSV-4VP2蛋白的主要抗原性区域位于199aa～414aa，而1aa～199aa(N端)和414aa～1060aa(C端)都无免疫原性[7]。AHSV-4VP2有15个抗原位点，分成两组。一组覆盖范围223aa～400aa，包含12个抗原位点；另一组覆盖范围568aa～681aa，包含其他的3个抗原位点。VP5和VP2相互作用，能更好地将VP2的中和表位展现出来，从而增强免疫反应。15个位点中有3个可诱导产生AHSV-4的中和抗体，其中有2个中和表位分别位于321aa～339aa和377aa～400aa[7]。这两个表位联合起来可诱导产生更有效的中和反应，但中和抗体滴度相对较低，不大可能用于生产AHSV的合成疫苗。此效果可能是由于抗体与一个表位结合后引起构象变化，使得其他抗体与另一表位的结合更容易；另一原因可能是此两位点的中和反应在病毒感染中有不同的作用(如病毒与细胞的吸附，病毒的易位等)或它们构成了一个相对不连续表位的连续部分。ASHV-9VP2也有两个中和表位[5]。同时，BTV在相同的区域也有中和表位，尤其是在328aa～335aa之间和327aa～402aa之间。因此，此区域可能是环状病毒的一个主要抗原表位和重要的中和抗体靶位。这些表位可能在病毒衣壳的表面，因为中和表位通常结合在病毒表面以阻止病毒与细胞的受体结合而被细胞摄取。尤其是两个中和表位在蛋白疏水性最强的区域，极有可能存在于病毒的表面。用ELISA检测[7]这15个抗原位点，发现抗原位点8，11和12能与抗体结合，而抗原位点4，6和15虽然能与抗体发生反应，但它们不表现中和活性，尤其是位点4，它虽然在病毒表面，但不诱导产生中和抗体。其他位点不与抗体反应，说明它们可能埋入病毒非洲马瘟病毒内部排列表面或虽然暴露于病毒表面，以不被抗体识别的构象形式存在。2.2　VP5蛋白VP5蛋白由M6基因编码。M6基因5′-端非编码区的保守序列为5′-GUUAA-3′，此特点也体现在与AHSV相关的BTV和流行性出血热病毒(epizootichaemorrhagicdiseasevirus，EHDV)中。而3′-端非编码区的保守序列为5′-ACAUAC-3′，唯一的例外是AHSV-6，它的3′-端多一个胞嘧啶核苷酸，为5′-ACAUACC-3′。M6基因的ORF编码蛋白的分子质量约56.9ku。AHSV-6，AHSV-4，BTV-10和EHDV-1的VP5氨基酸序列有较高的一致性[8]。3个保守区域位于N端(1aa～123aa)，中部(192aa～273aa)和C端(438aa～491aa)。这些保守区域可能与VP2或VP7相互作用，从而保持病毒结构的稳定性。作为一个外壳蛋白，ASHV各血清型之间的VP5蛋白有很高的相似性，VP5被VP2蛋白包围，不能与宿主发生中和反应。VP5蛋白根据疏水性分布图分为两个部分[8]，N端区域(1aa～220aa)和C端区域(约280aa～505aa)，中间是一个丙氨酸-甘氨酸富集区(200aa～270aa)作为铰链将两部分连接。N端为螺旋状，而C端是球形结构。这些区域在蛋白相互作用的分子内和分子间起稳定分子结构的作用。VP5的重要功能是与更保守的核心蛋白相互作用，以及补偿VP2蛋白的变化。VP5能间接影响病毒的血清型，它与VP2相互作用，改变VP2的构象，从而引起病毒血清学特性的变化。VP5在昆虫细胞中单独表达或与VP2共表达都能诱导产生AHSV特异性中和抗体[9]。VP5蛋白免疫显性最明显的区域在N端的330个残基中，有两个抗原区域，151aa～200aa和83aa～120aa，分为8个抗原位点，中和表位在85aa～92aa和179aa～185aa。前一个中和表位在不同的环状病毒中高度保守，它的单克隆抗体能识别BTV和EHDV的VP5蛋白。2.3　VP7蛋白和VP3蛋白VP7蛋白和VP3蛋白分别由S7和L3基因编码，是该病毒主要的内衣壳蛋白。VP7在ASHV各血清中高度保守，是该非洲马瘟抗原结构病毒的血清群特异性抗原[10]。MareeS等[11]用重组杆状病毒在昆虫细胞中克隆表达了ASHV-9的VP3和VP7，VP7表达水平高且聚集成独特的晶体，VP3和VP7共表达可在细胞中形成类核心颗粒。AHSVVP7蛋白在感染细胞的胞浆中形成平面六边形晶体，而由重组杆状病毒表达的VP7则形成大的盘片状晶体，在光镜下可见。在电镜下观察AHSV的VP3和VP7蛋白形成的类核心颗粒与ASHV空核心颗粒非常相似。与ASHV核心不同的是，类核心颗粒有一暗的中央区域，呈典型的20面体对称结构。外层包围着一低电子密度层，在形态上呈结节状突起，并向外延伸，形成有绒毛外观的类核心颗粒。AHSV类核心颗粒的直径约为72nm，与BTV的类核心颗粒在冰冻时电镜下的直径一致，但比ASHV核心颗粒的直径稍大。用VP7单克隆抗体与AHSV类核心颗粒反应，对它进行抗体修饰，电镜下可见每个颗粒都被一层阴影包围，那是VP7单克隆抗体与VP7外壳相互作用形成的。Wade-Evans等研究了AHSV-9VP7作为亚单位疫苗的应用效果。以提纯的AHSV-9VP7晶体免疫接种小鼠，用AHSV-7攻毒，发现VP7对小鼠的保护作用非常好。用变性的VP7晶体或细菌原核表达的GST-VP7融合蛋白接种所产生的保护作用比用VP7晶体接种所产生的保护作用要弱，说明VP7蛋白的构象对蛋白的功能有重要作用。而来自用AHSV-9VP7免疫的Balb/c小鼠的被动抗体不能保护新生同系小鼠不受AHSV-7的攻击，这说明抗体可能不是唯一起保护作用的因素。 该病毒有3个非结构蛋白，即NS1，NS2和NS3/NS3A。分别由M5，S8和S10基因编码。3.1　NS1蛋白NS1在AHSV中高度保守。Huismans和Els于1979年就发现在环状病毒感染的细胞胞浆中有独特的病毒特异性微管非洲马瘟病毒重组过程结构，它由NS1组成。在BTV感染的细胞中存在着大量此类微管，主要在胞核附近或周围。这些形态结构黏附在细胞骨架的中间丝上。它们的作用可能是把成熟病毒粒子从病毒包涵体运到细胞膜，而后由NS3的作用将病毒释放，或作为分子伴侣防止在次要蛋白(VP1，VP4和VP6)与病毒的基因组正确合并前组装核心颗粒。BTV和EHDV的NS1用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达后都形成了微管。BTV的NS1微管直径52.3nm，由NS1二聚体形成的螺旋组成，每个螺旋有22个NS1二聚体。Maree和Huismans用杆状病毒在昆虫细胞中表达AHSV-6NS1，并用蔗糖梯度密度离心沉降分析NS1微管，在200S～400S处收集到大量目的片段，说明表达的NS1蛋白以微粒或聚合体形式存在于感染细胞中。虽然NS1是这些片段最主要的蛋白成分，但也有数量不等的某些其他蛋白，推测为杆状病毒的蛋白。在200S～400S的NS1复合物中，微管的平均直径为23nm±2nm，长度最长可达4μm。长度不等可能是由于提纯过程中发生了断裂，这也可能是NS1在蔗糖梯度中有不同沉降系数的原因。在电镜下观察，AHSV微管的精细结构与BTV和EHDV微管在外观上很不相同。AHSV微管有一内部结构，呈细微的网状交叉波纹状。每个微管的中央区域有交替伸展的电子密度，而低密度区表示微管的空腔。微管的边缘平滑，界线分明，无可见的亚单位结构。在更宽的BTV微管(68nm)和EHDV微管(52nn)中无梯状或分节段的外观。中空环状结构可能表示微管的横切面或大微管的非常短的小节段。这些结构的直径与ASHV微管相符，其空腔直径约为7nm。在200S～400S片段中还有少量杆状病毒的特异性微管。这些微管与AHSV微管明显不同，它们更大(直径40nm)，且精细结构也不同。可用抗体鉴定AHSV微管。将微管固定在网格上，用ASHV-6抗血清与之结合。由于抗体与NS1结合，电镜下观察可见在NS1微管周围有暗影，而杆状病毒微管则无。NS1微管在0.2mol/L和更高浓度的CaCl2中不稳定，只能见到无定形的蛋白聚集物。在1mol/L的NaCl中，只能见到少量微管，它们的长度明显减小，环状形态非常多。在缓冲液中或pH8.0～8.5之间，微管形态也受到严重影响，长度减小，精细结构消失。NS1微管能耐受相对低的pH，但在碱性条件下，它们比BTV微管更易降解。在pH5.0～5.5之间，微管的长度减小，而表面则变得不平滑。在pH5.0或更低时，微管变性，NS1聚集成无定形的蛋白聚集物。3.2　NS3/NS3A蛋白与NS1和NS2的高表达水平相比，两个最小的非结构蛋白NS3和NS3A在感染细胞中合成量很少。这两个相关的蛋 白由S10基因上两个同相重叠的开放阅读框编码，两者唯一的不同是NS3的N末端比NS3A多10个氨基酸。NS3存在于感染细胞的胞膜中，特别是在Vero细胞胞膜上的AHSV释放位点，说明NS3与病毒的形态发生和释放有关。病毒释放可先于细胞病变效应或细胞溶解而发生。由重组杆状病毒表达的AHSVNS3是膜相关蛋白，它的定位不依赖于AHSV颗粒的存在。此外，ASHVNS3用重组杆状病毒表达时只合成24ku的NS3蛋白，不合成NS3A。AHSVNS3的变异率在AHSV各蛋白中仅次于外衣壳蛋白VP2[12]。ASHV-8的NS3型间变异率达27.6%，而ASHV-4的NS3型间变异率只有15%。型间变异率大可用来区分同型病毒的亚群。NS3序列的差异可用于区分同种血清型的野毒株和弱毒活疫苗株，2.3%～9.7%的变异率就足以进行区分，尤其是与系统进化分析联合应用时。ASHVNS3的种系发生研究将NS3蛋白分成3个不同的种系发生谱系，命名为α，β和γ[13]。AHSV-4，5，6，8和9的NS3属α，ASHV-3，7和8的NS3属β，ASHV-2的NS3属γ。虽然3个NS3进化群区别明显，但是某一特定AHSVNS3属于哪个进化群并不是只由病毒血清型决定。AHSV的基因重排可以解释一些较大的变异率。基因重排在分节段基因组的病毒中是自然发生的，如正黏病毒(Orthomyxovirus)和呼肠病毒。多个ASHV血清型混合感染斑马和马都可能使得S10片段在不同血清型之间发生重组。NS3表型群的血清型分组提示那些在同一NS3进化群中的血清型病毒更易发生S10基因的交换。AHSV-3至9的NS3长为217aa，而ASHV-2的NS3蛋白则有218aa。NS3的保守区域包括NS3A的甲硫氨酸起始密码子，一个脯氨酸富集区(22aa～34aa)，43aa～92aa的高度保守区，以及可形成跨膜螺旋的两个疏水结构域(116aa～137aa和154aa～170aa)[14]。这些结构特征在其他环状病毒包括BTV的NS3蛋白中很普遍。BTVNS3的两个疏水区域跨越胞膜[15]。BTVNS3还有糖基化位点，此糖基化作用可以阻止BTVNS3降解[15]。除了一些保守特性，AHSVNS3与BTVNS3有很大的不同。没有证据表明AHSVNS3的糖基化有重要作用，因为某些病毒血清型的NS3没有推测的糖基化序列。BTVNS3在杆状病毒表达系统中高水平表达，而AHSVNS3的表达水平低，只能以免疫印迹或放射性标记法来检测。AHSVNS3中大部分有差异的氨基酸存在于3个区域，即N端的43个氨基酸，93aa～153aa之间和C端的15个氨基酸。变异最大的区域(变异率为82.4%)位于136aa～153aa之间。ASHV除了AHSV-2，所有血清型的NS3蛋白在第123aa处有一保守的半胱氨酸，ASHV-2NS3蛋白的半胱氨酸在第120aa处，而第2个半胱氨酸(164aa)在所有血清型中都保守。此外，还有一个高度保守的N-十四烷基化基序(60aa～65aa或59aa～64aa)，位于蛋白在细胞膜上的锚定区域。在十四烷基化基序的末端是一个带阳性电荷的氨基酸区域。这两个特点都在上述所说的43aa～92aa的高度保守区域内。与其它环状病毒的NS3蛋白比较，所有这些蛋白的氨基末端区域的N-十四烷基化基序高度保守。仅仅十四烷基化还不能给蛋白提供足够的能量使之附着在磷脂双层膜上。其他病毒的膜相关/结合蛋白，如Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV-1)的Gag蛋白和劳氏肉瘤病毒的Src蛋白，含有一个碱性氨基酸区域，它能稳定膜的相互作用。所有环状病毒NS3蛋白中有一个类似的二联基序，它可能是NS3蛋白的膜靶向信号。ASHVNS3的两个疏水区与细胞毒性效应有关。任意一个疏水区的变异不会改变蛋白对膜的靶向性，但能解除它们在膜上的锚定，从而阻止它们在细胞表面的定位并消除它们的细胞毒性效应。杆状病毒表达的AHSVNS3对昆虫细胞(Spodopterafrugiperda，Sf9细胞)的细胞毒性效应是通过改变细胞膜的通透性而实现的。

8. 非洲马瘟的防制

预防：尚无有效药物治疗。感染区应对未感染马进行免疫接种，如多价苗、单价苗(适用于病毒已定型)、单价灭活苗(仅适用于血清4型)。中国尚未发现此病，为防止从国外传人，禁止从发病国家输入易感动物。处理：发生可疑病例时，按《中华人民共和国动物防疫法》规定，采取紧急、强制性的控制和扑灭措施。采样进行病毒鉴定，确诊病原及血清型，扑杀病马及同群马，尸体进行深埋或焚烧销毁处理。采用杀虫剂、驱虫剂或筛网捕捉等控制媒介昆虫。